近日，华南师范大学环境学院应光国教授团队高方舟副研究员等人在Nature旗下期刊《Communications Earth & Environment》发表了有关环境微生物组和抗生素耐药的最新研究成果。
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引言
抗菌素耐药性（AMR）已成为全球公共卫生威胁，“同一健康”框架强调人类、动物与环境之间的连通性。然而，环境 AMR 研究主要聚焦河流、湖泊和土壤等地表环境，作为农村饮水、农业灌溉和畜牧业重要水源的地下水却长期未被充分纳入 AMR 监测体系。以中国为例，地下水资源有限但利用广泛，且污染较为严重；地下水开采和地表污染物下渗可增强污染物、病原微生物与人体之间的生态连通性，从而增加健康风险。
近年来发现，地下水中广泛存在可穿过 0.22 μm 滤膜的小尺寸微生物（SMs）。其中既包括基因组精简、代谢能力有限的超小型微生物类群，如 Patescibacteriota 和 DPANN 古菌，也包括处于生长状态、细长形态或细胞大小可变的其他微生物。由于常规测序和培养方法通常依赖 0.22 μm 或更大孔径的过滤步骤，SMs 往往被遗漏；其低丰度也进一步限制了检测与解析。地下水的低营养、低氧、有机质输入有限和停留时间长等特征，可能塑造具有特殊生物学属性的 SMs，但其分类组成、耐药性特征及与人类肠道耐药组的关联仍缺乏系统认识。
因此，本研究以农村地下水 SMs 为对象，结合深度宏基因组、宏转录组和培养方法，解析其群落组成、病原体及功能性和高风险 ARGs；进一步评估其时空变化、天然状态及复苏后的抗生素耐受性，并比较地下水 SMs 与当地居民肠道微生物组之间的耐药组共享，以评估其作为潜在 AMR 储库的公共卫生意义。
研究方法
研究在中国南部博白县 8 个村庄采集农村井水，并于半年后在其中 1 个村庄重复采样。采用 0.22 μm 与 0.1 μm 滤膜顺序过滤，将 0.1–0.22 μm 小尺寸微生物富集；提取 DNA 和 RNA，开展深度宏基因组与宏转录组测序，并以 0.22 μm 滤膜截留的大尺寸微生物作为比较。研究利用参考基因组数据库分析群落和病原体，使用 ARGs-OAP 定量 ARG、筛选高风险 ARG，并通过组装、分箱获得 MAGs，注释 ARG、毒力基因及其宿主。针对 Patescibacteriota 中的 mef(B)，进一步进行数据库比对、分子对接、基因克隆和药敏验证。研究还开展 17 种抗生素的群落培养药敏试验及扩增子测序，并采集当地居民粪便样本，通过 ARG 共享、同源基因、MGE 共定位和 ANI 比较，评估地下水与人肠道耐药组的潜在关联。
主要结果
1. 小尺寸微生物的时空异质性及其与大尺寸组分的差异
研究在地下水 SMs 中鉴定出 139 个门、8,252 个物种，群落以 Pseudomonadota 为主，平均占检出类群的 84.9%，也贡献约 73.0% 的转录本。Acinetobacter 和 Aquabacterium 为优势属，A. baumannii 是最丰富物种。SMs 的绝对丰度为 127–153,000 cells/mL，物种丰富度、Shannon 多样性和均匀度均在村庄间显著变化，群落组成也表现出显著空间分异。半年后的重复采样显示，SMs 总丰度略降但不显著，群落组成则显著改变；不过，Acinetobacter 仍持续占优势。与大尺寸微生物（LMs）相比，SMs 生物量低约两个数量级、多样性更低，且群落组成显著不同；SMs 中占优势的 Acinetobacter 和 Aquabacterium 在 LMs 中罕见，说明其并非仅是大尺寸群落的简单缩小部分。
图 1｜地下水中小尺寸微生物（SMs）的研究设计及其分布。
a，地图显示 8 个村庄，彩色方块表示村委会位置；数值表示成功测序的宏基因组/宏转录组数量。实验设计展示样品预处理流程及主要研究内容。b，前 4 个优势门的相对丰度；括号内数值为 18 对宏基因组和宏转录组中的平均比例。c，前 10 个优势属的相对丰度。d，地下水中 SMs 的绝对丰度。箱线图显示中位数（中心线）、四分位距（箱体；IQR）、数据分布范围（须线，1.5 × IQR）及离群值（单独点）。所有村庄间及两村庄间的差异分别采用 Kruskal–Wallis 检验和 Wilcoxon 检验；p 值经 Benjamini–Hochberg 方法校正。Kruskal–Wallis 检验显著后，采用 Dunn’s 检验进行事后两两比较（q < 0.05）。不同字母表示 Wilcoxon 检验下组间差异显著（q < 0.05）。e，SMs 样品间的非度量多维尺度分析（NMDS）；村庄间差异采用 Adonis 检验。彩色圆圈表示各村庄内的标准差，置信区间为 95%。f，SMs 与大尺寸微生物（LMs）之间的 NMDS；差异采用 Adonis 检验，彩色圆圈表示 95% 置信区间下的标准差。g，18 对宏基因组和宏转录组中病原体的平均相对丰度。红线及灰色阴影分别表示线性回归曲线及其 95% 置信区间；灰色/粉色方块分别表示丰度低于/高于每百万 reads 1 个拷贝；黑线表示两类数据集中的丰度相等。属名缩写：A.，Acinetobacter；B.，Brevundimonas；C.，Comamonas；D.，Delftia；M.，Moraxella；R.，Rhodococcus 或 Ralstonia；S.，Sphingomonas。e 和 f 中的 p 值均经 Benjamini–Hochberg 方法校正，表示为 q 值。
2. SMs 中存在多种病原体
SMs 中共检出 15 种 BSL-1、156 种 BSL-2 和 16 种 BSL-3 病原体。前十种病原体占全部病原体丰度的 90.3%，其中 6 种属于 Acinetobacter。A. baumannii 平均相对丰度最高（15.9%），其次为 A. pittii（6.23%）；还检出 A. junii、A. bereziniae、A. soli 和 A. lwoffii 等潜在病原种。病原体在宏基因组中的相对丰度与其转录信号高度相关（R² = 0.845，p < 0.0001），多数类群的转录本/基因组丰度比接近 1，部分 Acinetobacter 类群高于 1，表明这些小尺寸组分中的病原体不仅存在，而且具有较高的转录活性。
图 2｜小尺寸微生物携带的抗生素抗性基因（ARGs）特征。
a，ARG 谱的 NMDS 分析。箱线图表示中位数、四分位距、1.5 × IQR 范围及离群值。村庄间差异采用 Adonis 检验，彩色圆圈表示 95% 置信区间下村庄内的标准差。b，总 ARG 的绝对丰度。所有村庄间及两村庄间差异分别采用 Kruskal–Wallis 检验和 Wilcoxon 检验；p 值经 Benjamini–Hochberg 方法校正，显著的 Kruskal–Wallis 检验后采用 Dunn’s 检验进行两两比较（q < 0.05）。不同字母表示 Wilcoxon 检验下组间差异显著（q < 0.05）。c，前 11 类 ARG 的相对丰度；括号内为 18 对宏基因组和宏转录组中各类 ARG 的平均比例。d，检出的 Risk Rank I 和 II 类 ARG 构成；圆圈大小表示各基因在全部 Risk Rank I 或 II 类 ARG 中的平均比例，优势 ARG 标注基因名称。e，18 对宏基因组和宏转录组中 Risk Rank I 和 II 类 ARG 在转录本与基因水平间平均相对丰度的差异；数值为转录本丰度与基因丰度比值的以 10 为底对数转换。MLS，大环内酯–林可酰胺–链阳菌素。
3. SMs 携带多样且具有转录活性的高风险 ARGs
SMs 中共识别出 29 类、1,136 种 ARG 亚型；其组成及绝对丰度在村庄间显著不同，丰度范围为 43–105,000 copies/mL。杆菌肽、多重耐药和多黏菌素抗性基因在 DNA 水平最丰富，但其转录贡献相对较低；相反，氨基糖苷类抗性基因仅占 ARG 总丰度的 2.9%，却贡献了 56.4% 的 ARG 转录本。研究进一步筛得 81 种 Risk Rank I 和 67 种 Risk Rank II 高风险 ARG，其中包括高丰度的 APH(6)-Id、APH(3″)-Ib、tet(A)、sul1 和 floR。在具有配对宏基因组和宏转录组的数据中，67.0% 的 ARG 亚型具有转录活性，且高风险 ARG 中转录本/基因组比值大于 1 的比例达 73.1%，提示其潜在风险并非仅由基因储存所致。
图 3｜宏基因组组装基因组（MAGs）的基因组特征。
a，古菌和细菌 MAG 的系统发育树。b，携带 ARG 及毒力因子基因（VFGs）的 MAG 的系统发育关系和基因组质量。当某 MAG 至少检出一种 ARG 或 VFG 时，相应的 ARG 类型或 VFG 机制以颜色标示。两图中分类单元后的数值表示该类群包含的 MAG 数量。
4. ARG 宿主主要为 Acinetobacter
研究共重建 1,157 个 MAG，包括 123 个古菌和 1,034 个细菌基因组；其中包含 DPANN 古菌和 Patescibacteriota 等超小型类群，也包含通常被视为大尺寸微生物的 Pseudomonadota、Actinomycetota 和 Bacteroidota。约 65.8% 的 MAG 无法注释至物种水平，显示地下水 SMs 含有大量尚未充分认识的微生物多样性。227 个 MAG 被识别为 ARG 宿主，涉及 8 个门、40 个物种和 17 个未分类类群。Acinetobacter 的 ARG 数量和多样性最高，共包含 54 个 MAG；多个 A. baumannii、A. pittii、A. junii 等 BSL-2 病原体 MAG 同时携带 β-内酰胺类、喹诺酮类、四环素类、多重耐药等 ARG 及多类毒力因子，且在基因组和转录组中均表现出较高覆盖度。
图 4｜携带 mef(B) 的 MAG 的基因组特征及 mef(B) 抗生素抗性验证。
a，bin.64_STUW2 MAG 的基因组特征。ORF，开放阅读框；CDS，编码序列；ARG，抗生素抗性基因。b，在 414 种重要病原体中，mef(B) 在染色体、质粒、基因组岛（GI）和全基因组组装序列（WGS）中的检出情况。数据汇总自 CARD 数据库（访问日期：2025 年 5 月 5 日）；数值表示至少检出一个 mef(B) 命中的物种比例。c，将 mef(B)-ORF 及其所在 contig 与 NCBI nt 数据库（访问日期：2025 年 5 月 5 日）比对；图中展示序列一致性和覆盖度最高的匹配物种。d，红霉素和阿奇霉素的分子对接与基因克隆结果；培养皿显示克隆或未克隆菌株对两种抗生素的最小抑菌浓度（MIC）。
5. 在 Patescibacteriota 中发现并验证功能性 mef(B)
研究在隶属于 Patescibacteriota、属水平为 CAJVWL01 的 MAG 中发现大环内酯抗性基因 mef(B)。该 MAG 质量较高，在 CheckM1 和 CheckM2 中的完整度分别为 72.1% 和 93.0%，污染度分别为 0% 和 1.37%；其在 4 个地下水样品中被检出。对 GTDB 和 NCBI 中超过 15,000 个 Patescibacteriota 基因组的检索未发现同源记录，表明这可能是该类群中 mef(B) 的首次报道。该 ORF 与已知 mef(B) 序列高度相似，但含有 15 个碱基差异和 3 个氨基酸替换。分子对接与克隆表达均证实其可介导红霉素和阿奇霉素抗性：克隆后阿奇霉素 MIC 为 32 μg/mL，为未克隆菌株的 16 倍；红霉素 MIC 超过 512 μg/mL。
6. SMs 在地下水中耐药性较低，但复苏后部分物种耐受性增强
在天然地下水 SMs 中，研究分离到可在头孢他啶、头孢噻肟、头孢吡肟或多黏菌素 B 存在下生长的 65 株菌。它们均属于革兰氏阳性类群，包括 Bacillus_A、Cytobacillus 和 Peribacillus；多数菌株对头孢他啶的 MIC 超过 256 μg/mL。基因组分析显示，Bacillus_A 携带多种 β-内酰胺酶基因及毒力因子，而其他属可能依赖尚未解析的抗性机制。与之相比，地下水中占优势的 Acinetobacter 等革兰氏阴性菌表现出较低耐受性。SMs 经 LB 培养复苏后，在 10 类抗生素压力下获得耐受的群落包含 9 个门、62 个物种和 17 种 BSL-2 病原体；其中包括 5 种 Acinetobacter。A. baumannii 可耐受 5 种抗生素，提示部分 SMs 在有利环境中可快速恢复或增强耐药表型。
图 5｜对抗生素具有耐受性的 SMs 的组成。
a，65 株可在含抗生素培养基上生长的分离菌株的系统发育关系和基因组特征。图中展示其对头孢他啶、头孢噻肟和头孢吡肟的 MIC，以及 ARG 和 VFG 的检出情况。b，经复苏后对不同抗生素具有耐受性的 SMs 的分类范围；完整结果见表 S23。每个彩色节点代表一个物种。MLS，大环内酯–林可酰胺–链阳菌素。
7. 地下水 SMs 与当地居民肠道微生物组共享耐药组
地下水 SMs 与当地居民肠道微生物组共检出 653 种 ARG 亚型，其中 83 种在两类样品中检出频率均超过 80%，61 种平均丰度超过 0.01 copy/cell。共享 ARG 中包括 75 种 Risk Rank I 和 42 种 Risk Rank II 基因；在高丰度或高频共享 ARG 中，高风险基因的比例进一步升高。氨基糖苷类基因是 Risk Rank I ARG 的主要组成，AAC(6′)-Ie-APH(2″)-Ia 和 APH(3′)-IIIa 最常见；四环素类基因则在 Risk Rank II 中占优势。研究还鉴定出 42 个在地下水和人体肠道中具有 100% 序列一致性和覆盖度的 ARG 同源序列，其中包括 16 个 Risk Rank I 和 4 个 Risk Rank II 基因。绝大多数同源 ARG 位于质粒，34 个在 5 kb 邻域内与 MGE 共定位，提示两类耐药组之间可能存在较强的遗传连通性。
图 6｜地下水小尺寸微生物与人类肠道微生物组之间的耐药组共享。
a，两类生境间共享的 ARG 亚型。Venn 图数值表示特有或共享的 ARG 亚型数量；右下角百分比表示各组全部 ARG 中 Risk Rank I 和 II 类 ARG 的比例。b，检出的 Risk Rank I–IV 类 ARG 组成；圆圈大小表示各基因在全部人体和地下水样品中相应风险等级 ARG 的平均比例，优势 ARG 标注基因名称。c，ARG 同源序列的检出情况。MGE，可移动遗传元件；MLS，大环内酯–林可酰胺–链阳菌素；ORF，开放阅读框。
结论
本研究揭示了农村地下水中长期被常规过滤方法忽视的小尺寸微生物（SMs）是重要的 AMR 潜在储库。SMs 在空间和时间上具有高度异质性，且与大尺寸微生物在群落组成上显著不同；其中 Acinetobacter 等潜在病原体占优势并保持较高转录活性。SMs 携带多样、部分转录活跃的 ARGs，包括大量高风险 ARG；基因组解析进一步表明，Acinetobacter 是主要 ARG 宿主，并在 Patescibacteriota 中首次发现并验证了具有大环内酯抗性功能的 mef(B)。尽管天然地下水中多数 SMs 的抗生素耐受性较低，部分微生物在复苏后可表现出增强的耐受性，提示其具有潜伏的耐药风险。地下水 SMs 与当地居民肠道微生物组共享大量 ARG 及高度同源序列，部分与可移动遗传元件相关，表明二者可能存在耐药组连通性。研究强调，应将 SMs 纳入地下水 AMR 监测及饮水安全风险评估。
致谢
本研究得到国家自然科学基金项目（42030703、U22A20604 和 42307359）的资助。同时感谢广东省科学技术协会青年科技人才托举工程（SKXRC2025008）和广东省高等学校青年创新人才项目（2023KQNCX019）的支持。
全文引用：Gao, FZ., Li, P., Huang, ZC. et al. Small-sized microbes from rural groundwater showed antimicrobial resistance and resistome sharing with human microbiomes. Commun Earth Environ 7, 672 (2026).
撰稿：高方舟
初审：白 红
复审：孙怡苑
终审：应光国